週一. 9 月 20th, 2021

12個研發抗毒藥物心得與諸友分享

▼生成的正鏈可作為mRNA,指導蛋白質的合成或作為病毒基因組。(圖/李重德提供)

【李重德/專欄報導2021/08/27】 重德研讀了幾篇有關鋅離子抑制冠狀病毒的論文之後,已經略有心得了,當然,這些資料對於一個非此領域的人來說都是非常巨量而且索然無味的,但是重德想要提綱挈領的把幾個關鍵性的重點提出來和各位好友討論與分享,因為這是大家交了 重德 這樣一個勇於承擔大任者的一個“預知福利”。

以下就是重德最近的一些心得,與大家共同討論之:【討論01】 正鏈RNA病毒如何在細胞內進行複製呢?一般來說生物學家是根據RNA能否直接起mRNA作用而分成單股正鏈RNA病毒(正股RNA病毒)與單股負鏈RNA病毒(負股RNA病毒)兩種。

(1)正股RNA病毒(如脊髓灰質炎病毒)的單股RNA可直接起mRNA作用,轉譯早期蛋白質,包括RNA多聚酶和抑制宿主細胞合成代謝的調控蛋白。然後在RNA多聚酶的作用下,以單股RNA(正股)為模板,形成互補股(負股),兩者結合成雙股,稱為複製型。再由負股產生出許多新的RNA(正股),成為複製中間體。此新的正股RNA可作為mRNA合成衣殼蛋白。

(2)負股RNA病毒(如正粘病毒、副粘病毒、彈狀病毒)的單股RNA不能作為mRNA,稱為負股,須先合成互補股(正股)作為mRNA,再轉譯蛋白分子,而後產生核酸的複製型,成為合成子代病毒RNA的模板。

因此,正鏈RNA病毒的基因組為一條正股的單鏈RNA,病毒體本身不攜帶RNA複製酶。

其遺傳信息傳遞過程分成以下幾種方式:

(1).正鏈RNA進入宿主細胞後,一些直接作為mRNA鏈指導蛋白質的合成;這些蛋白質產物有依賴RNA的RNA聚合酶(RdRp)及衣殼蛋白。

(2).另一些正鏈RNA可以通過此RdRp酶的作用,生成負鏈,形成雙鏈形式的複製型中間體;接著此雙鏈可以解鏈,再以負鏈為模板,在RdRp作用下,生成大量新的正鏈RNA,達到複製的目的。

(3).生成的正鏈可作為mRNA,指導蛋白質的合成或作為病毒基因組。

(4).衣殼蛋白包裹正鏈RNA,組裝形成子代病毒。

【討論02】 正鏈RNA病毒包含哪一些病毒種類呢?

(1). 網巢病毒目(Nidovirales)

包含;動脈炎病毒科(Arteriviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、海洋病毒科(Mesoniviridae)、桿狀套病毒科(Roniviridae)。

(2). 小核糖核酸目(Picornavirales)

包含:二順反子病毒科(Dicistroviridae)、傳染性軟化病毒科(Iflaviridae)、海洋RNA病毒科(Marnaviridae)、微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、豇豆花葉病毒亞科(Comoviridae)、Bacillarnavirus、Labyrnavirus。

(3). 蕪菁黃花葉病毒目(Tymovirales)

包含:甲型線形病毒科(Alphaflexiviridae)、乙型線形病毒科(Betaflexiviridae)、丙型線形病毒科(Gammaflexiviridae)、蕪菁發黃鑲嵌病毒科(Tymoviridae)。

(4). 未設目的病毒科

包含:Alphatetraviridae、蜂窩狀病毒科(Alvernaviridae)、星狀病毒科(Astroviridae)、桿菌狀核糖核酸病毒科(Barnaviridae)、甜菜壞死黃脈病毒科(Benyviridae)、雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae):嵌杯病毒科(Carmotetraviridae)、修道院病毒科(Closteroviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、肝炎病毒科(Hepeviridae)、低毒性病毒科(Hypoviridae)、光滑病毒科(Leviviridae)、黃症病毒科(Luteoviridae)、裸露核糖核酸病毒(Narnaviridae)、野田病毒科(Nodaviridae)、派氏病毒科(Permutotetraviridae)、馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、披衣病毒科(Togaviridae)、番茄叢矮病毒科(Tombusviridae)、帚狀病毒科(Virgaviridae)等。

【討論03】 在正鏈RNA病毒的多種複制策略中居關鍵因素者為何?

正鏈RNA (+RNA) 病毒包括許多重要的病原體。它們已經進化出多種複制策略,但統一的事實是依賴於細胞內RNA已存在的RNA聚合酶(RdRps)作為病毒RNA合成機制的核心酶。而且RdRp 通常嵌入在由病毒 RNA、病毒和宿主蛋白組裝而成的膜相關複製複合物中。因此,有效的抑制RdRps 是抗病毒研究的關鍵目標。〈View Article〉。

重德認為由於正鏈RNA (+RNA) 病毒並不自己擁有RNA複製酶,因此它只能在進入細胞後利用細胞內原有的RNA RNA複製酶來促進病毒的複製,而目前大多數對抗COVID-19的疫苗設計都是促使人體的免疫系統對於COVID-19病毒有“受傷經驗”,而促使細胞在遇到外型與COVID-19病毒雷同的外來者時“閉門謝客”。

重德認為這樣的疫苗設計會產生了以下幾個盲區:

〈第一個盲區〉是要讓人體免疫系統有受傷經驗的刺激方法、施加劑量、傷害強度、有效期間、安全考量都是一個大考驗。

〈第二個盲區〉是人體的免疫系統下令細胞“閉門謝客”的可靠性、持久性、後遺症等等問題都必須針對不同人群加以計量評估。

〈第三個盲區〉是COVID-19病毒具有高變異特性與智慧型進化功能,因此疫苗的研製可能跟不上病毒的變異,而且病毒很可能會針對疫苗的對抗模式而進化以超越之。

重德針對COVID-19的詭譎多變的特性,認為目前COVID-19疫苗政策是一個源自於過去“人定勝天”的假設而發展出“以身試毒”的錯誤醫療政策。

因為COVID-19病毒可能係由多種尚無特效藥的病毒驚人為搭接而成的一種新病毒,因此奇病毒中即具有不斷鬥爭發展的基因,因此其變異模式與速度超出人類依據過去經驗所知曉的病毒變異範圍。

而重德目前正在研發的防治COVID-19病毒的模式則充分借重了所謂的“他力”,也就是鋅離子與多種鋅離子載體,並利用這兩者的綜合作用而發展“體外抗毒”與“體內抗毒”的兩種對抗COVID-19的模式。

“體外抗毒”指的是人體接觸到病毒的“初介面抗毒”,這包含手、臉(口、鼻、眼)、食道、氣管、肺、胃。其研發的目標是找到讓高濃度鋅離子“站崗”與“問口令”的機制。

“體內抗毒”指的是讓如吡啶硫酮鋅(PTZ)這樣的鋅離子載體能更有效地變成COVID-19病毒標靶藥物,最好是在COVID-19病毒攻擊細胞之前則已經預留在人體細胞內待命,但是必須觀察其長期抑制細胞內RNA的RdRps活性會有怎樣的後遺症。

當然,對於進入細胞內的COVID-19病毒RNA還是要給予最終的處理,重德認為當然還是必須仰賴“他力”才能解決問題,重德 的著力點很可能是在讓mRNA鏈指導蛋白質的合成失效的這一個方向上。

【討論04】為何增加細胞內 Zn2+ 濃度能削弱 RNA 病毒複製呢?

鋅離子被證明可以抑制感染細胞和無細胞系統中冠狀病毒複製酶多蛋白加工過程中的某些蛋白水解裂解,這主要的因素是通過干擾病毒多蛋白的正確蛋白水解加工。〈View Article〉〈View Article〉這種效果可能基於對巢狀病毒 RdRps 的直接抑制。〈View Article〉。

雖然醫學界尚未能明白細胞內存在高濃度的鋅離子可以抑制RdRps 活性的真正原因,但是重德認為這很可能是一種讓RdRps處於“昏睡狀況”的情形,因為當我們再給予MgEDTA之後不久RdRps即恢復了原來的活性。因此,鋅離子就如同酒精一樣具有麻醉功能,因此鋅離子必須要有足夠的濃度才能起到這種麻醉功能。

【討論05】為何食用或注射鋅離子並不能提高細胞內的鋅濃度呢?

因為細胞內的金屬硫蛋白將細胞內游離 Zn2+ 的濃度維持在相對較低的水平,這可能是因為 Zn2+ 可作為細胞內第二信使,在升高的濃度下可能引發細胞凋亡或蛋白質合成減少。〈View Article〉〈View Article〉〈View Article〉

更何況單獨的鋅離子是無法直接穿透細胞壁而進入細胞內的,這就是為何需要鋅離子必須要與吡啶硫酮(PT)螯合成為PTZ的原因,因為只有這樣的螯合物才能藉著交換螯合物質的方式來將鋅離子送進細胞之內。

重德用一個譬喻來說明這一個情況,那就是“吡啶硫酮”(PT)如同是“槍枝”,“鋅離子Zn2+ ”則是“子彈”,“吡啶硫酮鋅”(PTZ)就是一把“子彈上膛的槍枝”。

【討論06】為何低濃度的鋅離子並無抑制病毒複製的作用呢?

鋅離子參與許多不同的細胞過程,並已證明對各種細胞酶和轉錄因子的正確折疊和活性至關重要。 Zn2+ 也可能是許多病毒蛋白的重要輔助因子〈View Article〉〈View Article〉。

我們評估了在 0 到 8 µM ZnOAc2 存在下一系列 PT 濃度 (0–32 µM) 的細胞毒性。發現當 ZnOAc2 的濃度小於 4 µM 時,整體細胞蛋白質合成沒有變化(數據未顯示)。〈View Article〉

我們測試了 Zn2+ 添加對 RTC 活性的影響。對於 EAV和 SARS-CoV,當存在 ZnOAc2 時,觀察到合成的 RNA 量呈劑量依賴性下降。對於這兩種病毒,在 50 µM 的 Zn2+ 濃度下觀察到總 RNA 合成減少了 50% 以上,而在 500 µM 的 Zn2+ 濃度下仍保持不到 5% 的活性。基因組合成和 sg mRNA 產生同樣受到影響。〈View Article〉

【討論07】 適當濃度鋅離子對哪些病毒的複製有抑制效果呢?

1. 針對小核糖核酸病毒進行了合理詳細的研究後證明在細胞培養中,PT 在數分鐘內刺激Zn2+攝取並通過一種機制抑制 RNA 病毒複製。〈View Article〉〈View Article〉

2. 對純化的鼻病毒和脊髓灰質炎病毒 3C 蛋白酶進行的體外研究表明,蛋白酶活性被 Zn2+ 抑制。〈View Article〉〈View Article〉

3. 在感染人鼻病毒和柯薩奇病毒B3的細胞中觀察到的鋅離子對多蛋白加工的抑製作用。〈View Article〉〈View Article〉

4. Zn2+對來自鼻病毒和丙型肝炎病毒的純化RdRps的活性有抑製作用。〈View Article〉〈View Article〉

5. 鋅離子被證明可以抑制感染細胞和無細胞系統中冠狀病毒複製酶多蛋白加工過程中的某些蛋白水解裂解。〈View Article〉〈View Article〉

【討論08】 在缺少吡啶硫酮(PT)情況下鋅離子能抑制病毒複製嗎?

我們發現單獨添加 ZnOAc2 也減少了病毒複製,但僅在接近 Vero-E6 細胞中 ZnOAc2 的 50% 細胞毒性濃度(CC50)的水平(~70 µM,數據未顯示)。這可能是由於 Zn2+ 在含磷酸鹽的培養基中溶解度差,以及在沒有鋅離子載體的情況下細胞對 Zn2+ 的吸收效率低下。〈View Article〉

【討論09】 單用吡啶硫酮(PT)與併用鋅離子的效果有何差異呢?

通過單獨添加 PT,SARS-CoV-GFP 和 EAV-GFP 的報告基因表達已經以劑量依賴性方式顯著抑制。當向培養基中加入 2 µM Zn2+ 時,這種效果會顯著增強。

但是2 µM PT 和 2 µM ZnOAc2 的組合使 EAV-GFP 和 SARS-CoV-GFP 的 GFP 信號分別降低了 98±1% 和 85±3%。對於 PT 和 ZnOAc2 濃度的這種組合,也沒有觀察到細胞毒性。〈View Article〉

【討論10】 何種鋅離子載體可以抑制 RNA 病毒的複制呢?

在細胞培養研究中,我們發現高 Zn2+ 濃度和添加刺激細胞輸入 Zn2+ 的化合物,如檜醇 (HK)、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯 (PDTC) 和吡啶硫酮 (PT),可抑制各種 RNA 病毒的複制,包括流感病毒、呼吸道合胞病毒和幾種小核糖核酸病毒。〈View Article〉〈View Article〉〈View Article〉〈View Article〉〈View Article〉〈View Article〉

吡啶硫酮(PT)與鋅離子的螯合物就稱作為吡啶硫酮鋅或奧麥丁鋅,簡稱PTZ,其化學式是C10H8N2O2S2Zn,其能作為推動鋅離子穿透細胞皮膜而進到細胞內部去抑制可支持病毒RNA複製的RdRps的活性,依據 重德 的研究猜測原因主要是PTZ為螯合體,並具有極低的溶解度(約8 ppm),也很可能與其是良好的殺真菌劑和殺藻劑有關。

重德認為,因為其具有甚低溶解度使得PTZ可以完整無損的到達細胞壁,更因為其具有殺真菌與殺藻的天性,而使得PTZ會循著標靶病毒的軌跡去殺菌。而且PTZ在到達被病毒侵入的細胞壁時,會因為要螯合那一些病毒的殘體而會釋放出Zn2+,因此Zn2+ 就自然循著病毒軌跡而穿透細胞壁,並進入細胞來抑制RdRps的活性。

重德的這一個論點也可以用於說明為何伊維菌素(ivermectin)也有不錯的防治COVID-19的效果,因為伊維菌素之所以是一種很有效的殺蟲劑,是因為其用機制是使增加無脊椎動物的細胞壁可透性,因此它自然也可能會穿透受病毒感染的細胞壁而進去殺死病毒,但是這是一種殺戮方式,對SARS-CoV-2的半抑制濃度大約為2.2–2.8μM,因此若要對COVID-19產生抑制效果則其所需劑量遠高於人用最高批准劑量、亦超過可安全實現劑量。因此遠不如PTZ來的安全有效。

【討論11】 鋅離子對流感病毒與SARS病毒的抑制作用有何異同呢?

實驗證實,低濃度 Zn2+ 和 PT(2 µM Zn2+ 和 2 µM PT)的組合可抑制細胞培養中 SARS 冠狀病毒 (SARS-CoV) 和馬動脈炎病毒 (EAV) 的複制。因為這兩種遠親巢狀病毒的 RNA 合成由於依賴於細胞內原有的 RNA 聚合酶 (RdRps) 來催化,因此,RdRps 是其多蛋白複製和轉錄複合物 (RTC) 的核心酶。而Zn2+ 被PT螯合後,將很有效率地穿透細胞壁而被送進細胞中去抑制RdRps,因此只要有2 µM Zn2+ 便足以長期抑制RdRps的活性了。〈View Article〉

但是Zn2+ 雖然會阻斷 EAV RNA 合成的起始步驟,但是對於病毒延伸期的抑制效果並沒有那麼理想。〈View Article〉

EAV-GFP 編碼 GFP 與病毒非結構蛋白 2 (nsp2) 的 N 端融合,病毒非結構蛋白 2 (nsp2) 是複制酶多蛋白的切割產物之一,因此為複制酶基因的翻譯提供直接讀數。〈View Article〉

這是因為分段負鏈 RNA 病毒(例如流感病毒)的複制不依賴於多蛋白加工,因此PDTC介導的Zn2+ 輸入的影響EAV RNA 合成的起始步,其實是由於 Zn2+ 抑制了病毒 RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)和細胞輔助因子,但是一旦發展出負鏈 RNA 病毒後便再由負股產生出許多新的RNA(正股),成為複製中間體。此新的正股RNA可作為mRNA合成衣殼蛋白(請參考【討論01】)。〈View Article〉

然而在 SARS-CoV 的情況下,RdRps 的延伸一直受到Zn2+ 抑制,因此模板的結合減少。〈View Article〉

在 SARS-CoV-GFP 中,報告基因從 sg mRNA 7 開始表達,在替換了兩個輔助蛋白編碼基因(ORF 7a 和 7b)之後,這些基因對於細胞培養中的複製是可有可無的。〈View Article〉

【討論12】 為何MgEDTA可以逆轉鋅離子的抑制病毒作用呢?

MgEDTA (乙二胺四乙酸二鈉鎂)是一種螯合劑可用以逆轉 Zn2+ 介導的抑製作用,因為它在釋放 Mg2+ 的同時特異性螯合 Zn2+,這是由於 ZnEDTA 複合物具有更高的穩定性常數。〈View Article〉

而且,Mg2+不能產生如同Zn2+的抑制病毒所依賴的RNA聚合酶 (RdRp)的效果,所以MgEDTA所帶來的高濃度Mg2+,將使得病毒所依賴的RNA聚合酶 (RdRp)的活性恢復。

重德認為由這一個可逆的實驗,顯示出Zn2+的抑制病毒複製主要憑藉是高濃度的Zn2+讓病毒 RNA 依賴性 RNA 聚合酶 (RdRp) 和細胞輔助因子暫時性的失去活性,而不是消滅它,因此算是一種讓病毒複製功能呈現“昏迷狀態”。

重德認為既然提供高濃度的Zn2+ 也只能讓被感染者不發病與不具傳染力而已,因此很可能這一些病毒將長期潛伏在人體中,因此,重德認為最好的防治方法就是不讓病毒侵入人體,也就是在“體外”就因為“電位中和”而被消滅掉,其次才是在體內進行有效的“抑制複製”。

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